La Domus Galilaeana è collocata nell’antico Palazzo della Specola dello Studio pisano, il primo osservatorio astronomico pubblico della Toscana, la cui costruzione risale al 1734-35. L’edificio era stato appositamente dotato di un’alta torre, costruita sui resti di una più antica, ma nel 1826, a causa della precaria stabilità, fu demolita. In questo stesso complesso erano collocati anche parte della Biblioteca Universitaria e il Gabinetto di Chimica.
L'idea di creare un istituto dedicato la figura di Galileo Galilei e allo studio del suo pensiero scientifico nacque in previsione delle celebrazioni per il centenario della Prima riunione degli scienziati italiani, tenutasi a Pisa nel 1839: nel 1941 fu così istituita Domus Galilaeana
Nell’edificio oggi si conservano 40.000 tra volumi e opuscoli, tra cui si segnalano, per valore e unicità, una lettera autografa di Galileo Galilei contenente la prima formulazione della legge di caduta dei gravi (1604) e vario materiale iconografico relativo allo scienziato pisano; l'archivio di Antonio Pacinotti, inventore della dinamo e del motore elettrico; il carteggio di Antonio Favaro, curatore della monumentale edizione nazionale delle opere di Galileo (1890-1909); gli appunti lasciati dai fisici Enrico Fermi ed Ettore Majorana.
Nel corso della sua storia l’ente ha conservato varie strumentazioni scientifiche per conto di altre istituzioni, tra i quali la "macchinetta" di Pacinotti, primo modello di motore dinamo elettrico e la CEP, Calcolatrice Elettronica Pisana, poi confluite nelle collezioni del Museo degli Strumenti per il Calcolo. Il materiale attualmente presente alla Domus è strettamente legato ai fondi archivistici presenti, come le "Sorgenti" per gli esperimenti sulla radioattività indotta di Fermi e la strumentazione fotografica dell'astronomo Pio Emanuelli.