Il museo ha sede negli ambienti dell'antico monastero benedettino femminile di S. Matteo in Soarta (XI secolo), di cui oggi, oltre alla omonima chiesa, restano visibili solo alcune murature medievali, alterate da trasformazioni di epoca moderna e dai restauri del secondo dopoguerra.
Le strutture claustrali tardo-medievali furono realizzate in laterizio in cui si aprono bifore con colonnine e capitelli quasi tutti originali (piano superiore). Il porticato fu in buona parte ristrutturato nel XVI secolo, insieme ad altre aree oggi non fruibili al pubblico. Agli inizi dell'Ottocento vi fu istituito un capitolo di canonichesse ed è probabile che a questo periodo risalga la facciata d'ingresso, di stile neoclassico. Dal 1866 al 1940 vi fu insediato il carcere giudiziario cittadino, con importanti modifiche strutturali.
La trasformazione funzionale e il restauro del complesso edilizio risalgono invece agli anni successivi al secondo conflitto mondiale: nel 1949 nacque il Museo Nazionale di S. Matteo, ordinato da Piero Sanpaolesi secondo criteri basati sulla validità estetica delle opere. In tempi più recenti si è preferito presentare i materiali per tipologie e cercando di ricomporre i complessi originari.
Il museo attualmente è sede della raccolta artistica più ampia delle città. Conserva infatti una cospicua quantità di ceramiche medievali, costituita una ricca serie di bacini ceramici di area mediterranea e dal vasellame medievale e di età moderna proveniente da vari ritrovamenti cittadini (raccolta Tongiorgi). Per l’oreficeria si segnalano alcuni preziosi oggetti, che si accompagnano ad una selezione di monete e di sigilli medievali (collezioni Franceschi e Supino). Di grande importanza è la sezione dedicata ai codici miniati, che conserva esemplari dal XII al XIV secolo, rimarchevoli per la ricchezza delle illustrazioni. La collezione di scultura lapidea comprende opere dal medioevo al Cinquecento, tra cui spiccano notevoli testimonianze del periodo "romanico" e i capolavori di Nicola Pisano e Donatello. Assai nutrite e di massimo rilievo sono le raccolte di scultura in legno e di pittura: questa annovera più di 200 opere realizzate tra gli inizi del XII secolo e l’età moderna da importanti artisti tra i quali Giunta Pisano, Berlinghiero, Simone Martini e Masaccio.